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如何制作气凝胶?

浏览:0 发布日期:2019-01-27

  气凝胶又称冻胶。溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接,形成空间网状结构,结构空隙中充满了作为分散介质的液体(在干凝胶中也可以是气体),这样一种特殊的分散体系称作凝胶。没有流动性。内部常含有大量液体。例如血凝胶、琼脂的含水量都可达99%以上。可分为弹性凝胶和脆性凝胶。弹性凝胶失去分散介质后,体积显著缩小,而当重新吸收分散介质时,体积又重新膨胀,例如明胶等。脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时,形状和体积都不改变,例如硅胶等。由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为胶凝作用(gelation)。那么如何制作气凝胶呢?

  生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性,然后通过实验选择出最有效的纯化流程。

  1.测定——分子量、PI:当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中,可简易地测出PI,并选择纯化用缓冲液的最佳PH.

  2.选择——层析方法:若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解,可尝试几种不同的纯化方法:

  a、使用最通用的凝胶过滤方法,选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。

  b、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质,再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。

  c、体积大的样品,往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品,可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理,洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。

  3。纯化——大量粗品:处理大量原液时,为避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质,直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率,缩短纯化周期。

  4.纯化——硫酸氨:样品硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品,经处理过的样本处于高盐状态下,很适合直接上疏水层析。若作离子交换,需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术,随着介质种类不断增多,渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。

  5.纯水——糖类分子:固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素,可结合碳水化合物的糖类残基,很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器,纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质,专为俘获整个细胞或大复合物,如膜囊等。

  6。纯化——膜蛋白:膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者,避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质,籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。

  7.纯化——单抗、抗原 :单抗多为IgG.来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用,能一步纯化各种不同源的IgG.血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理,在培养前除去IgG.重组蛋白A介质 Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性,基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200,很容易去除。疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG.宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mg IgM.HiTrap IgY是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY.

  8.纯化——重组蛋白:重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物,扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。


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